本制品是一种非变性快速去糖基化试剂盒。与去糖基化酶(PNGase F)(货号：YTC0005)去除N-糖基化修饰需要几小时甚至过夜相比，本试剂盒仅需50℃孵育10分钟即可完成对糖蛋白N-聚糖链的去除，同时保留蛋白内部二硫键和整体三维构象的完整，可有效缩短样品处理时间，处理后的样品可用于SDS-PAGE、Western、高效液相色谱(HPLC)或质谱分析等。本试剂盒也可以间接用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的糖基化水平检测。
Rapid PNGase F与PNGase F功能相同，通过E.coli重组表达，可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和天冬酰胺(Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖，将蛋白和糖链修饰分开(图1)。本试剂盒提供的Rapid PNGase F的N端带有His-tag，反应后通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1．使用本试剂盒移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(Pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被Rapid PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
本试剂盒去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果如图2所示。
图2．使用本试剂盒去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果图。图中上图为Non-reducing SDS-PAGE，即SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中不含DTT、巯基乙醇等还原性试剂，抗体重链(Heavy chain,HC)和轻链(Light chain,LC)之间的二硫键和两条重链铰链区(Hinge region)之间的二硫键都没有被破坏，因此电泳条带在150kDa左右；图中下图为Reducing SDS-PAGE，即SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中含有DTT、巯基乙醇等还原性试剂，抗体内部二硫键全部被破坏，重链和轻链分开，因此电泳条带有两条：重链在50kDa左右，轻链在23kDa左右(轻链条带图中未展示)。C (Control)为未处理的对照。RP (Rapid PNGase F)为非变性方法(Native Method)去除糖基化。在20μL反应体系中，10μg不同种属的IgG分别加入1μL Rapid PNGase F (Native)，50℃孵育10分钟。经PAGE预制胶(Hepes,4～15%,15孔)电泳，并经考马斯亮蓝超快染色液染色。图中下图还原条件下的电泳可清晰观察到去糖基化后重链(HC)条带的迁移速率明显加快，图中上图的非还原条件下的电泳也有类似效果。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Native deglycosylation)。
- 变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；
- 非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能[1-3]。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
抗体药物的生产中调节和控制糖基化修饰对抗体的活性、药代动力学和免疫原性都有着重要影响。例如在IgG的Fc部分Asn297处有一个保守的N-聚糖链，很多抗体还有额外的N-聚糖链，这些N-聚糖链可能对抗体的活性、半衰期和免疫反应至关重要；而且细胞培养过程中的变量，可能进一步增加抗体糖基化修饰的多样性，因此N-聚糖链的表征和质量控制是抗体药物的关键质量属性(CQAs)之一。
| 组分 | 25T | 100T | 500T |
| Rapid PNGase F (Native) | 25μL | 100μL | 500μL |
| 5×Native Reaction Buffer | 100μL | 400μL | 2mL |
保存：-20℃，有效期1年。
- Rapid PNGase F (Native)不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
- 避免使用含有SDS的缓冲液，SDS会抑制Rapid PNGase F的酶活性。
- Tween、Triton X-100、NP-40、辛基葡萄糖苷、非去垢剂磺基甜菜碱，以及有机溶剂都会抑制Rapid PNGase F (Native)的酶活性。
- 超纯水推荐选购无菌无酶超纯水(货号：YT998)。
不同糖蛋白的最佳反应用量、孵育时间，可根据聚糖种类、下游分析要求进行调整。通常情况下，1μL Rapid PNGase F(Native)可完成10μg抗体N-聚糖链的去除。反应体系可以根据需要进行放大。
- 按下表在离心管中配制反应体系，并充分混匀。
成分 用量 Protein (10μg) x μL 5×Native Reaction Buffer 4μL 超纯水 至19μL - 75℃孵育5分钟。
- 冷却至室温后加1μL Rapid PNGase F(Native)，并充分混匀。
- 50℃孵育10分钟。
- 后续即可进行SDS-PAGE、Western等常规分析。如果后续采用质谱分析去糖基化蛋白，推荐使用BalbDesalt脱盐柱对溶液进行置换。
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